聚焦藥典三部—生物制劑檢測(cè)，人血蛋白鋁殘留量測(cè)定，單抗電荷變異體測(cè)定和單抗N糖譜測(cè)定

2005年起，藥典增加了以生物制劑（診斷、預(yù)防等）為主要內(nèi)容的第三部?！吨袊幍洹啡吭从凇吨袊镏破芬?guī)程》。自1951年以來，該規(guī)程已有六版頒布執(zhí)行，分別為1951年及1952年修訂版、1959年版、 1979年版、1990年版及1993年版（診斷制品類）、1995年版、2000年版及2002年增補(bǔ)版。2002年翻譯出版了第一部英文版《中國生物制品規(guī)程》（2000年版）。

在2020年版《中國藥典》三部中檢測(cè)方法的變化主要體現(xiàn)在3個(gè)方面：

1.通則《3208 人血白蛋白鋁的檢測(cè)》中，增加第二法ICP-MS法。

2.通則《3129 單抗電荷變異體測(cè)定法》中使用iCIEF毛細(xì)管等電聚焦技術(shù)對(duì)抗體藥物檢測(cè)。

3.通則《3130 單抗N糖譜測(cè)定法》中使用UHPLC法檢測(cè)抗體藥物。

3208 人血白蛋白鋁殘留量測(cè)定法

原理：本法系用原子吸收分光光度法測(cè)定人血白蛋白制品中鋁的殘留量。?

方法：精密量取供試品、100 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)鋁溶液（精密量取100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)鉛溶液0.1 mL，置100 mL量瓶中，用0.15 mol/L硝酸溶液稀釋至刻度），分別制備空白對(duì)照溶液、供試品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品加供試品的混合溶液。照原子吸收分光光度法（通則0405）測(cè)定，選擇鋁燈，測(cè)定波氏為309.3 nm，狹縫為0.7 nm。

?B為空白對(duì)照溶液瀆數(shù)；S₀為供試品溶液讀數(shù)；S為標(biāo)準(zhǔn)鋁加供試品的混合溶液讀數(shù)；20為標(biāo)準(zhǔn)鋁加供試品的混合溶液中標(biāo)準(zhǔn)鋁的含量；12.5 為供試品稀釋倍數(shù)。

設(shè)置石墨爐的干燥、灰化、原子化等爐溫程序。精密量取空白對(duì)照溶液、供試品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品+供試品的混合溶液各30 μL分別注入儀器、讀數(shù)。

新版2020藥典增加ICP-MS法測(cè)量，準(zhǔn)確度更高、靈敏度更好。

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3129 單抗電荷變異體測(cè)定法

單克隆抗體是一種復(fù)雜的糖蛋白，作為一種全新的生物制劑，可以治療腫瘤、風(fēng)濕等多種疾病。復(fù)雜的細(xì)胞培養(yǎng)工藝、純化及制劑等制造過程或儲(chǔ)存過程可能給單抗制劑引入各種修飾形成的變異體，它們通常呈現(xiàn)微觀不均一性。因此，抗體所帶的電荷就會(huì)存在差異，這些變異體可能會(huì)影響抗體的穩(wěn)定性，藥效，免疫原性等，因此對(duì)電荷變異體的表征和質(zhì)控至關(guān)重要。通過對(duì)變異體的分子量及肽圖的表征，可以確定其修飾種類及后續(xù)QC中的質(zhì)量監(jiān)控。

目前，電荷變異體分析常用的PH梯度或鹽梯度方法。由于流動(dòng)相一般含不揮發(fā)性鹽，需要色譜分離除鹽凍干再進(jìn)質(zhì)譜分析。這一過程復(fù)雜容易造成樣品損失及蛋白變性，因此使用低離子強(qiáng)度、揮發(fā)性鹽的流動(dòng)體系，在PH梯度條件下分離電荷變異體，同時(shí)進(jìn)質(zhì)譜分析，能夠快速在完整蛋白水平上表征變異體修飾，包括C端賴氨酸變異體、脫酰胺、焦谷氨酸環(huán)化、糖化以及抗體相關(guān)片段等。主要步驟為：完整分子量分析，輕重鏈分析以及肽圖分析。

原理：藥典三部通則中采用全柱成像毛細(xì)管等電聚焦電泳（iCIEF)，依據(jù)不同電荷變異體的等電點(diǎn)（pI）特征，按毛細(xì)管電泳法（通則0542)將其分離 ，測(cè)定單抗產(chǎn)品各電荷變異體的等電點(diǎn)并計(jì)算相對(duì)百分含量。

電荷變化是測(cè)定單抗藥物降解變異最靈敏快速的方法之一，已經(jīng)被國內(nèi)外生物制藥企業(yè)廣泛采用。全柱成像毛細(xì)管等電聚焦電泳（iCIEF）為Proteinsimple首創(chuàng)全景式動(dòng)態(tài)等電聚焦分析技術(shù)，已經(jīng)成為等電點(diǎn)檢測(cè)及電荷異質(zhì)性分析的行業(yè)金標(biāo)準(zhǔn)。

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注意事項(xiàng)：1、如供試品的鹽濃度較高，需對(duì)其進(jìn)行脫鹽前處理。 2、由于 iCIEF 分析儀器品牌不同、毛細(xì)管品牌或者規(guī)格存在差異，系統(tǒng)適用性對(duì)照品的電泳圖譜與參考圖譜峰型可略有差異。

3130 單抗N糖譜測(cè)定法

第一法 親水相互作用色譜法：親水作用色譜柱（HPLC）

第二法 毛細(xì)管電泳法：CE

第三法? 高效陰離子色譜法：離子色譜法

HPAEC-PAD離子色譜具有方便、快速、靈敏度高、選擇性好、重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確度高、可同時(shí)分析多種離子化合物等優(yōu)點(diǎn)。其中的高效陰離子交換色譜－脈沖安培檢測(cè)法( HPAEC-PAD) 可直接分析糖類物質(zhì)，應(yīng)用于多糖疫苗及多糖蛋白結(jié)合疫苗中多糖的分析。

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近年來，離子色譜應(yīng)用在多糖及多糖蛋白結(jié)合疫苗的質(zhì)量控制中，如測(cè)定疫苗中的多糖、游離糖、雜質(zhì)多糖、對(duì)人有免疫原性的功能基團(tuán)等的研究有許多報(bào)道。該方法可以加強(qiáng)多糖疫苗N糖（氨基端糖鏈的）結(jié)構(gòu)分析與鑒別的質(zhì)量控制。